检验杂学2艾滋病实验室检测

疾病预防控制局统计年9月全国共报告法定传染病例，死亡人，其中艾滋病发病数例，死亡数例。年9月27日，第五届全国艾滋病学术大会在云南省昆明市召开国家卫生健康委党组成员王建军指出艾滋病防控形势依然严峻，要坚持预防为主和群防群控，紧密围绕《中国遏制与防治艾滋病“十三五”行动计划》，进一步提高宣传教育的针对性、综合干预的有效性、检测咨询的可及性和随访服务的规范性，全面落实血液筛查核酸检测、预防母婴传播、救治救助政策和社会组织培育引导。年12月1日是第31个“世界艾滋病日”，参考联合国艾滋病规划署宣传活动主题，我国年宣传活动主题为“主动检测，知艾防艾，共享健康”(英文主题为“Knowyourstatus”，知道你的感染状况)。活动主题旨在强调开展艾滋病检测工作对防治艾滋病、实现“三个90%”目标和共享健康生活的重要意义。明确检测是知晓艾滋病感染状况的唯一途径。倡导通过检测知晓感染状况，进而采取治疗和预防措施，有助于控制艾滋病，共享健康生活，为健康中国建设作出贡献。

艾滋病在我国的流行已数十年，随着感染者和临床病人的不断增加、感染人群的变化，艾滋病检测工作量逐渐加大，对监测和检测的需求也不断增加，本文简单介绍了几种艾滋病的实验室检测方法。

1.HIV抗体检测

适用于从HIV感染窗口期后至艾滋病患者死亡的整个病程中的抗体检测，是最常用的艾滋病实验室诊断方法。由于母体抗体的干扰，该方法不适用于18个月以下的婴幼儿。检测方法分为筛查试验和确证试验两大类，每一类又包括实验原理不同的多种方法。

1.1筛查试验

1.1.1酶联免疫吸附试验(ELISA):可使用血液(包含血清、血浆和滤纸干血斑)、尿液样品，ELISA多为HIV抗体检测试剂。HIV抗原抗体联合检测试剂可同时检测血液中HIV-1p24抗原和HIV-1/2抗体。HIV抗原/抗体包被于固相载体，加入待检样品和酶标记的HIV抗原/抗体，加底物显色，用酶标仪测定结果。有效试验的阴性和阳性对照必须符合试剂盒规定。

1.1.2化学发光或免疫荧光试验(CIA/IFA):采用发光或荧光底物，可使用血液(包含血清和血浆)、尿液样品，既可检测抗体，也可联合检测抗原抗体。HIV抗原/抗体包被于固相载体，加入待检样品和酶或荧光标记的HIV抗原/抗体，加发光或荧光底物，用发光或荧光仪测定结果。有效试验的阴性和阳性对照必须符合试剂盒规定。

1.1.3快速检测(RT)及其它试验:可使用血液、口腔黏膜渗出液，操作简便快速，适用于应急检测、门诊急诊检测、VCT及检测点等。一般可在10～30分钟内得出结果。明胶颗粒凝集试验(PA)：是HIV抗体检测的一种简便方法。将HIV抗原致敏的明胶颗粒，与待检样品作用。当待检样品含有HIV抗体时，明胶颗粒与抗体发生凝集反应，根据凝集情况判读结果。PA试剂有两种:同时检测HIV-1和HIV-2抗体以及分别检测HIV-1和HIV-2抗体。有效试验的阴性和阳性对照质控，需符合试剂盒的规定。免疫渗滤试验：斑点ELISA和斑点免疫胶体金(或胶体硒)快速试验：均以硝酸纤维膜为载体，HIV抗原点状或线状固定在膜上，加待检样品，利用微孔滤膜的可滤过性，使抗原抗体反应。阳性结果在膜上抗原部位显示出有色斑点或条带。反应时间在10分钟以内。有效试验的质控点必须显色。免疫层析试验：以硝酸纤维膜为载体，HIV抗原线状固定在膜上，待检样品沿着固相载体迁移，阳性结果在膜上抗原部位显示出有色条带。有效试验的质控带必须显色。反应时间在30分钟以内。

筛查报告:无反应报告为“HIV抗体阴性”；有反应必须进行复检，复检两次检测均无反应报告为“HIV抗体阴性”，复检检测均有反应或一个有反应一个无反应需进行“确证试验”；报告为“HIV感染待确定”，不能出具阳性报告。HIV抗体筛查报告需由一名检验人员和一名审核者签字。

1.2确证试验

1.2.1免疫印迹试验(WB):可使用血清、血浆和滤纸干血斑。WB采用间接法检测样品中的抗HIV-1/HIV-2特异性抗体。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳把分子量大小不等的HIV-1蛋白分离开来，然后再把这些分离的不同蛋白带转移到硝酸纤维素膜上(或PVDF膜)。将此膜切割成条状，每一膜条上均含有经电泳分离过的HIV抗原。待测样品经适当稀释后，加至硝酸纤维素膜上，恒温震荡，使其充分接触反应，血清中若含有HIV抗体，就会与膜条上抗原带相结合。加入抗人-IgG酶结合物和底物后，根据出现条带情况,按照试剂盒说明书判定标准，判断待测样品为阳性、阴性或不确定。

1.2.2条带/线性免疫试验(RIBA/LIA):采用间接法检测样品中的抗HIV-1/HIV-2特异性抗体。试剂盒的膜条上包被有HIV-1/HIV-2不同的重组抗原片段，加入待测样品后，其中的相应抗体与抗原发生特异性的免疫反应；随后加入抗人IgG(碱性磷酸酶标记)与HIV特异性IgG抗体相结合；加入显色底物后，在碱性磷酸酶的催化下，特异性抗体的结合部位出现肉眼可见的条带,按照试剂盒说明书判定标准，判断待测样品为阳性、阴性或不确定。

1.2.3其他方法：可用于确证的特定条件下的三种酶联免疫、三种快速试验或酶联加快速试验，免疫层析和免疫渗滤试验。

确证报告:(1)符合HIV-1抗体阳性判断标准，报告“HIV-1抗体阳性”，并按规定做好检测后咨询和疫情报告。符合HIV-2抗体阳性判断标准，报告“HIV-2抗体阳性”，并按规定做好检测后咨询和疫情报告。(2)符合HIV抗体阴性判断标准，报告“HIV抗体阴性”。如疑似“窗口期”感染，建议进一步做HIV核酸检测或2-4周后随访，尽早明确诊断。(3)符合HIV抗体不确定判断标准，报告“HIV抗体不确定”，在备注中应注明“2-4周后复检”或尽快做核酸检测。(4)HIV抗体确证检测报告应在收到样品后的7个工作日内发出。特定条件的用于确证的三种酶联免疫、三种快速试验或酶联加快速试验报告。

2.HIV-1抗原检测

适用于对人血液样品和病毒培养上清液中HIV-1p24抗原的检测。

2.1定性检测

2.1.1筛查试验

ELISA：抗体包被固相反应孔(管)的底部，待测样本中P24抗原与包被抗体形成抗原抗体复合物，再加入酶(HRP)标记的HIV-1抗体与抗原结合，加底物显色，在酶标仪上读取结果。

酶联荧光分析法(ELFA)：待测样品的p24抗原与包被在固相孔(管)内的p24抗体结合，并被生物素标记的p24抗体识别。经过碱性磷酸酶复合物孵育后加底物，酶复合物催化底物水解成荧光产物，此荧光可在nm波长处检测。对每份标本的固相孔(管)测量两次，第一次是加入底物前的背景读数，第二次是酶复合物催化底物水解后的读数。仪器自动分析计算相对荧光值(RFV)并自动报告判读结果。

电化学发光法(ECLIA)：待测样品的p24抗原与包被抗体的磁性微粒和发光剂标记的抗体在反应管中温育，形成磁性微珠包被抗体-抗原-发光剂标记抗体复合物。将复合物吸入流动室用三丙胺TPA缓冲液冲洗，流经电极表面时，结合了的磁性微珠被电极下的磁铁吸附，而游离的磁性微珠及发光剂标记抗体被冲走。同时在电极加电压，启动电化学发光反应，使发光试剂标记物和TPA在电极表面进行电子转移，产生电化学发光。仪器根据发光值(COI)判读结果。

抗原抗体快速检测法：待检样本中的HIV抗体、HIV-1p24抗原分别与样品垫中的HIV-1/HIV-2抗原、HIV-1p24单克隆抗体结合形成复合物，在毛细作用下沿着硝酸纤维膜向上移动，至相关抗体、抗原包被区域后，分别与之结合，组成有色复合物线条。质控线用于检测过程质量控制，肉眼判读检测结果。

筛选试验依据试剂盒说明书提供的标准判断有反应或无反应。

2.1.2中和试验

中和试验主要是p24抗原检测的补充试验，还可做HIV-1RNA的定性或定量检测，以排除筛查试验的假阳性。

ELISA：待检样品先与中和剂(p24抗原的抗体)共同孵育，如果样品中存在p24抗原，中和抗体将与之结合形成复合物，而不能与固相载体上的捕获抗体结合。之后，用这样处理过的样品重复筛查实验，同时做一孔未中和的原始样品对照，将中和与未中和孔的OD值进行比较，如果中和孔的OD值下降50%以上，认为样品中的p24抗原是真阳性；如果中和孔没有出现OD值的下降或下降的幅度不到50%，认为筛选试验p24抗原的反应性可能是假阳性，需要做RNA检测或随访做进一步确证。

ELFA：原理和检测步骤同上述酶联免疫吸附实验。结果判断方法为，比较中和与未中和样品的荧光值(RFV)，根据说明书提供的方法计算中和率，如果中和率大于或等于60%，认为样品中的p24抗原是真阳性；如果中和率小于60%，认为p24抗原的反应性可能是假阳性，需要做RNA检测或随访做进一步确证。

ECLIA：原理和检测步骤同上述酶联免疫吸附实验。结果判断方法为，比较中和与未中和样本的COI值，根据说明书提供的方法计算中和率，如果中和率大于50%，认为样品中的p24抗原是真阳性；如果中和率小于50%，认为p24抗原的反应性可能是假阳性，需要做RNA检测或随访做进一步确证。

2.2定量检测

将p24抗原的标准物质稀释成包含0.0和pg/ml两个浓度在内的六个不同浓度的系列标准，进行检测。横坐标为p24抗原的浓度(pg/ml)，纵坐标为OD值(酶联荧光分析法为RFV值、电化学发光法为COI值)，绘制出标准曲线。测出未知样品的反应值(OD值、或RFV值、或COI值)以后，可在标准曲线上查出抗原的浓度。如果未知样品的反应值超出标准曲线上最高抗原浓度的反应值，则需用正常人血清将样品稀释以后再行检测。自动化检测试剂及其配套的仪器，可根据储存于仪器中的标准曲线自动计算反应值并自动报告p24抗原的浓度(pg/ml)。

报告：对于定性检测，HIV-1p24抗原筛查试验有反应的样品必须经过中和试验确证以后才能判断阳性或阴性。HIV-1p24抗原阳性仅作为HIV感染的辅助诊断依据。HIV-1p24抗原阴性结果不能排除HIV感染。

3.HIV核酸检测

HIV-1核酸定性检测方法：血浆、血清、组织器官或血液制品等可用于检测HIV-1RNA和DNA。DBS可用于检测RNA/DNA。全球目前正式用于临床诊断HIV-1急性期感染的核酸检测试剂比较少，主要是美国FDA批准的Gen-Probe公司生产的AptimaHIV-1RNA核酸定性检测试剂和欧盟批准的AbbottMHIV-1RNA/DNA定性检测试剂。前者检测原理为转录介导等温扩增(TMA)和化学发光标记探针杂交检测，检测靶基因为HIV-1LTR和多聚酶基因；后者检测原理为Taqman实时荧光PCR扩增检测，检测靶基因为多聚酶区整合酶基因。国内生产的用于血浆及其血液制品筛查的核酸检测试剂主要为Taqman实时荧光PCR检测试剂。

HIV-1核酸定量检测原理主要基于靶核酸扩增RT-PCR和信号放大扩增两种方法。靶核酸扩增检测试剂包括Taqman荧光实时定量RT-PCR扩增试剂(RocheCobasTaqManv2.0和AbbottRealTimeHIV-1)和分子信标实时荧光定量RT-PCR靶核酸扩增试剂(NucliSENSEasyQ?HIV-1v2.0)；信号放大扩增系统包括分枝链DNA杂交扩增试剂(VersantHIV-1RNAbDNA3.0)。我国实验室常用国内外生产的实时荧光定量RT-PCR靶核酸扩增试剂(荧光探针法)。尽管目前国内外生产的HIV-1核酸定量检测试剂在检测中需要的样本量不同(0.1mL-1mL)，但均能在检测线性范围内准确地检测到c/mlHIV-1，有助于早期判断治疗失败、可定向实施依从性干预，确保抗病毒药物治疗效果。国内外定量检测试剂检测结果的报告单位，多为每毫升血中病毒的拷贝数(CPs/ml)。拷贝数与国际单位之间的转换可参照各检测试剂的说明或相关研究文献。目前没有商品化HIV-2定量检测试剂。

集合核酸定性检测(PoolingPCR)利用核酸检测方法的高度敏感性，对高危人群抗体检测阴性的样品进行集合核酸检测，可及时发现窗口期HIV-1感染者。该方法较单份样品的核酸检测具有更高的成本效益。

HIV核酸即时检测(POCT)是在发病或者发生事件的地点进行检测，能快速获得检测结果并及时反馈一线医务人员的一类检测方法。POCT检测适用范围广泛，且可避免样本长途运输导致的质量下降，非专业人员经培训后也可操作。可用于HIV-1感染、儿童早期HIV感染的辅助诊断、疾病监控及抗病毒药物疗效评价。

4.HIV-1新发感染检测

用于新发感染检测的方法包括HIV-1限制性抗原亲和力酶联免疫方法(LAg-AvidityEIA)和BEDHIV-1捕获酶联免疫方法(BED-CEIA)。LAg–AvidityEIA方法的原理是人体在感染HIV后产生的HIV-1特异性抗体对相应抗原的识别和结合能力随着感染时间的延长而增加，即亲和力逐渐增加。而BED-CEIA方法的原理是HIV特异性IgG占总IgG抗体的比例随着感染时间的延长而逐渐增高。两种方法均只适用于HIV-1抗体阳性样品。只应用于监测目的，不能用于个体诊断和临床。目前对两种方法的评价结果显示，LAg–AvidityEIA方法的假阳性率较BED-CEIA方法低，受疾病状态，如CD4细胞计数，抗病毒治疗等因素的影响较BED方法小，可以更加准确地区分新近感染和长期感染者。因此，BED-CEIA方法正逐渐被LAg–AvidityEIA方法所替代。此外，也有快速新发感染检测方法的研究报道，因其具有快速、简便、价格低廉等优点，未来对其需求将会越来越多。

5.CD4+和CD8+T淋巴细胞检测

CD4+T淋巴细胞数量可评价HIV感染者免疫状况，辅助临床进行疾病分期。机会性感染是艾滋病患者死亡的主要原因，CD4+T淋巴细胞可评估HIV感染者机会性感染的风险，辅助判断是否进行预防性治疗，如当CD4+T淋巴细胞＜/μl时，应给予抗肺孢子菌肺炎的预防性治疗。《国家免费艾滋病抗病毒药物治疗手册(第三版)》将CD4+T淋巴细胞数量作为是否开始抗病毒治疗的重要实验室指标之一，并规定治疗后定期检测CD4+T淋巴细胞数量，判断免疫系统恢复情况。CD8+T淋巴细胞为抑制性/细胞毒性T细胞，HIV感染者CD8+T细胞数量增加，导致CD4/CD8比值下降。

目前，CD4+和CD8+T淋巴细胞计数的方法分为两大类，一类是应用流式细胞仪测定法，另一类是非流式细胞仪测定法。常用的淋巴细胞计数检测方法为自动检测方法，包括流式细胞仪(主要有双平台法和单平台法)和专门的细胞计数仪。结果报告单中应附有正常值参考范围(例如，CD4+T淋巴细胞绝对数和百分数)。注意用于CD4+T淋巴细胞检测的不同仪器有不同的正常值范围，成人及不同年龄段儿童正常值范围亦不相同。

学习亮点：

获得性免疫缺陷综合征acquiredimmunodeficiencysyndrome，AIDS：指由HIV感染引起的以人体CD4+T淋巴细胞减少为特征的进行性免疫功能缺陷，继发各种机会性感染、恶性肿瘤和中枢神经系统病变的综合性疾患。

窗口期windowperiod：指从HIV侵进机体到血清HIV抗体转为阳性的时间，在窗口期内检测不出HIV抗体。

病毒载量viralload：指患者血浆(清)中HIVRNA的数目，属HIV核酸定量检测的指标，检测结果用每毫升血浆(清)中HIVRNA的拷贝数或国际单位来表示(c/mL或IU/mL)。

S/CO值:指ELISA试验测定得到的样本的HIV抗体光密度值与试剂检测的临界值(CutOffValue)之比，是抗体反应强度的指标，在一定范围内S/CO值越大，说明反应强度越高。

参考文献：

1.艾滋病和艾滋病病毒感染诊断标准.中华人民共和国卫生行业标准WS－8.

2.全国艾滋病检测技术规范(年版).中国疾病预防控制中心

转载请注明：http://www.hongxuandoor.com/jibzd/47531.html