HIV核酸病毒定量检测

一、HIV病毒载量

人类免疫缺陷病毒HIV(HumanImmunodeficiencyVirus，HIV)属于单股正链核糖核酸(RNA)逆转录病毒科慢病毒亚科，是艾滋病的主要病原体，主要传播途径为性传播、血液传播和母婴传播。至今，艾滋病仍然是无有效疗法的致命性传染病。HIV病毒基因组是两条相同的正链RNA，每条RNA长约9.2-9.8kb。HIV病毒载量是指血浆中的病毒负荷，即体内复制的病毒的数量，它可以准确地反映血液中病毒的活跃程度。

二、病毒载量检测的重要性

在艾滋病的预防过程中，艾滋病高危人群的诊断是“防艾”的关键环节。血清中HIVRNA是病毒复制和艾滋病进程的确切标志。所以血清中HIVRNA的检测已经成为诊断艾滋病的金标准方法，也是通过国家认证的临床PCR实验室常规检测项目之一，在艾滋病确诊、用药、疗效预判以及康复治疗过程中具有重要的指导意义。

检测HIV-1病毒载量可以监控和预测病程，指导艾滋病病人的HAART治疗，包括确定治疗时机、选择治疗方案、评价治疗效果；并且结合疾病临床症状和其他实验指标，还可用于早期感染的辅助诊断。另外，检测血浆HIV-1病毒载量还可作为婴儿早期HIV感染的辅助诊断以及采供血机构样品的窗口期检测方法。具体来说包括：

（1）监测抗病毒药物治疗效果。抗病毒药物治疗前后，定期病毒载量分析和监测，结合CD4+T淋巴细胞计数，有助于抗病毒药物治疗方案的确定和修改。

（2）监测疾病进展。定期检测HIV-1病毒载量，有助于监测感染者和病人的病程变化，结合CD4+T淋巴细胞计数，为抗病毒药物治疗提供病毒学依据。

（3）诊断急性HIV-1感染。针对HIV-1抗体筛查阴性、近期有流行病学史的个体，或确证结果不确定，核酸定量检测可用于诊断HIV-1急性期感染。

（4）确定HIV-1感染。针对HIV-1抗体筛查阳性或确证结果不确定的个体，结合流行病、和临床病史和CD4+T淋巴细胞计数等，使用核酸定量检测帮助确定HIV-1感染。

三、HIV-1病毒载量检测方法及现状

HIV-1病毒载量检测方法有多种原理，常用的包括核酸等温扩增、实时定量聚合酶链反应(polymerasechainreactionPCR)、分支DNA技术、非核酸的酶法检测等，另外很多交叉学科也在HIV检测方面进行了试验型探索。目前国际上常用的病毒载量检测方法主要有分支DNA杂交(BranchedDNA,bDNA)、核酸序列扩增(NucleicAcidSequenceBasedamplification，NASBA)方法及实时聚合酶链反应(RealtimePolymerasechainreation，实时-PCR)。分支DNA杂交(BranchedDNA,bDNA)基于其独特的信号放大系统，即分枝DNA信号放大系统，这是一个人工合成的分枝DNA，分枝DNA的分枝可结合多个酶标记物，从而将病毒的信号放大，以便进行检测。NASBA技术是一种等温扩增系统，其扩增基础在于系统内的混合酶系统，此系统内含有逆转录酶AMV-RT和T7-DNA多聚酶在体外模拟逆转录病毒体内复制过程。实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。这三种方法的原理、敏感性均不同，各有优势及不足。

随着HIV病毒载量应用的普及，检测技术的快速进步，目前HIV-1病毒载量检测技术总体上分为以下几个发展方向。

第一，实时荧光检测技术成为主流，该技术由于成本低、操作简单、技术积累丰富等优点，在病毒载量检测中发挥越来越大的作用。目前国内厂家的病毒载量检测试剂均是基于实时PCR技术开发的，其他技术例如分支DNA技术已逐步退出载量检测领域。

第二，检测设备趋向于一体化，或者是大型的全自动设备完成样本处理和检测，或者发展成小型的POCT（point-of-caretesting，现场快速检验）产品，而核酸等温扩增技术由于对反应条件要求很低，最有希望开发成POCT产品。第三，由于抗病毒药物的使用，多数HIV-1感染者血浆中的病毒会得到控制，表现为经典的病毒载量检测结果小于检测下限，此时为了更好地评价治疗效果，细胞基因组中整合的HIV成为研究热点，它的水平高低决定着患者预后。

由于HIV有很高的遗传变异性，所以对于HIV核酸检测试剂来说，所用扩增引物的保守性和基因型覆盖能力，以及检测不同基因型样本的灵敏度，是评价此类产品的性能之一，也是困扰当今HIV诊断试剂向国际化发展的壁垒之一。目前国内已上市的HIV核酸检测试剂不多，仅有6种，这些试剂都是针对HIV-1型的主要基因型进行检测，对HIV-1型中的不常见基因型则很难检测出来，从而造成漏检以及各亚型定量不准确，而且灵敏度低，一般在IU/ml左右，对于低值样本无法准确检测。国外性能优异的试剂有罗氏CAP-CTM-HIV-version-2.0试剂盒，灵敏度较高，但只能对HIVM组和O组样本进行检测，无法检测出HIV-N组样本，且试剂盒对样本需求量大，试剂和耗材价格比较昂贵，医院广泛开展。因此研究开发艾滋病病毒新一代核酸检测试剂，对实现对艾滋病病毒早期、超敏诊断成功，全面提升我国艾滋病的诊、防、治水平起着至关重要的作用。

中山大学达安基因股份有限公司

人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法）

注册证号：国械注准

试剂盒检测原理：本试剂盒利用荧光PCR技术，以HIV基因中相对保守区为靶区域，设计特异性引物及荧光探针，在样本核酸纯化之后，通过一步法RT-PCR对HIV-1RNA进行快速定量检测。另外，本试剂盒还带有内标物质，用于对核酸提取的整个过程进行监控，减少假阴性结果的出现。

使用本试剂盒提供的核酸提取试剂对临床样本进行处理和核酸提取，以试剂盒中提供的PCR检测试剂配制成PCR反应管，将提取的核酸加入PCR反应管中，使用荧光定量PCR仪进行一步法RT-PCR扩增，并检测荧光信号，仪器软件系统自动绘制出实时扩增曲线，根据阈循环值（CT值）实现对未知样本的定量检测。

质量控制：设置了强阳性质控品、临界阳性质控品、阴性质控品用于反应体系质量控制。

试剂盒的灵敏度高：灵敏度为IU/ml；按超敏步骤进行检测，可达50IU/ml

定量线性范围宽：线性范围为IU/ml～1.0×IU/ml

覆盖主要基因型：A亚型，B亚型，C亚型，D亚型、E亚型、F亚型

重复性好，精密度高：批内、批间CT值变异系数（CV）均5%。

特异性好：感染部位相同或感染症状相似的其他病毒（丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、EB病毒、人类疱疹病毒等）无交叉反应。

临床结果：临床研究结果显示，达安HIV试剂盒与参比试剂盒（罗氏）的检测结果阳性符合率为99.80%，阴性符合率为97.76%，Kappa检验一致性分析表明具有很好的一致性。

参考文献

[1]WHOGuidelinesApprovedbytheGuidelinesReviewCommittee．ConsolidatedGuidelinesontheUseofAntiretroviralDrugsforTreatingandPreventingHIVInfection：Re

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