基于网络药理学和分子对接研究当归四逆汤治
来源：《中国中药杂志》网络首发日期：-11-05
基于网络药理学和分子对接研究
当归四逆汤治疗原发性痛经的机制
卻丹华1通信作者，陈王焕1，
姜飞鹏1，潘菲1，杨科2
（1.医院药剂科；2.浙江工业大学药学院）
原发性痛经（primarydysmenorrhea，PD）是指月经前后及行经期间出现下腹疼痛、坠胀的病症，不伴随着器质性病变，临床上多见经期下腹痉挛性疼痛，其他症状伴有头痛、恶心、呕吐、腰腿酸痛，是年轻女性十分常见的病症。目前现代医学认为PD的发生与前列腺素、催产素、血管加压素、雌二醇、内皮素和β-内啡肽等有关，此外，情绪因素、运动、饮食习惯、环境等与PD发生也有相关性。中医认为PD的发生，是由于气血变化,瘀血阻滞胞宫、冲任失于濡养，从而导致“不通则痛”和“不荣则痛”。现代临床主要以心理辅导、口服非甾体抗炎药和口服避孕药治疗为主；中医治疗PD有2种办法：内治法和外治法；内治法以中药汤剂和中成药为主，如痛经宝颗粒可以很好地缓解经期疼痛，刘向东采用当归四逆汤原发性痛经效果明显；外治法主要以针灸疗法和中药贴敷疗法为主，如王腊梅等采用三伏贴对PD疗效显著，朱君利采用针灸治疗PD具有良好的临床效果。中医治疗PD的有效方法很多，在改善痛经症状及远期疗效方面有着独特的优势。
当归四逆汤记载于东汉张仲景所著《伤寒论》中，具有养血祛寒，温经通脉之功效，主治血脉凝涩，手足厥寒；或肠鸣腹痛，下利不止等病症。方中当归既能养血，又能和血养血为君；桂枝温通经脉，以畅血行，芍药益阴和营，二味相配，内疏厥阴，调和营卫为臣；细辛散表里内外之寒邪，通草入经通脉为佐；甘草、大枣温养脾气为使。诸药合用，有温养经脉，通畅血行之功。该方虽有千年历史，但因其配方严谨、配伍精良、疗效优异等而被广泛应用于临床。王美娟等采用归四逆汤联合热敏灸治疗原发性痛经效果显著；卞莹等采用当归四逆汤治疗寒湿凝滞型痛经，疗效比阳性药组更为明显。当归四逆汤治疗PD效果显著，但是现有的研究成果主要还是临床研究，其作用机制需要进一步的探究。
网络药理学是在系统生物学理论基础上发展起来的一门新的生物系统网络分析学科。网络药理学结合系统生物学、药理学和计算机技术等多学科技术，系统地探索中药潜在的有效成分和靶点，实现对药物疗效的全面网络分析。网络药理除了了解中草药配方治疗复杂疾病的复杂机制外，还与中药的多成分、多靶点和多机制作用的特征相一致。网络药理分析已应用于中药研究，以研究在生物网络中发挥作用的多靶标化合物，从而检测多种分子机制，网络药理学还可用于分析药效机制的合理性。
基于上述理论，作者在本研究中采用网络药理学的方法探讨当归四逆汤活性成分治疗PD的作用机制，构建当归四逆汤“中药-化合物-靶标-疾病”网络，为当归四逆汤的临床应用及PD的临床研究提供一定的参考。
1资料本实验所使用的的数据库、分析软件以及分析平台信息见表1。
2方法2.1当归四逆汤中化学成分收集
本实验利用TCMSP数据库，以“当归”“桂枝”“甘草”“通草”“大枣”“白芍”“细辛”为检索词，挖掘当归四逆汤中所有成分。
2.2当归四逆汤中活性成分以及靶标蛋白收集
根据上述所得成分的药物动力学参数进行筛选，将条件限定成药物口服利用度（oralbioavailability，OB）≥30%，类药性（druglikeness，DL）≥0.18，将满足条件的各药材成分于Drugbank中检索相关靶点，条件设置成homospices。
2.3原发性痛经疾病靶点收集与筛选
以“primarydysmenorrhea”“dysmenorrhea”为检索词在GeneCards，OMIM和TTD数据库中检索相应的靶点，合并去重得到原发性痛经的相关靶点。
2.4靶点基因名称的校正及当归四逆汤与原发性痛经共同靶点筛选
将2.2项所得当归四逆汤成分靶点与2.3项所得原发性痛经靶点，经Uniprot数据库校正基因名称，并利用Venny图制作平台制作成分靶点与疾病靶点交集图，获得交集靶点，进而获得当归四逆汤治疗原发性痛经的潜在治疗靶点。
2.5中药-化合物-靶标-疾病网络的构建
将2.4项所得到的靶点，在Excel中进行反向筛选，获得对应的活性成分和中药，在此基础上构建中药-化合物-靶标-疾病网络，并将其导入Cytoscape3.6.1软件进行可视化处理分析；结合药物Venny图，得出不同药物间的交集化合物。
2.6蛋白质相互作用网络
将2.4项所得到的靶点上传至STRING在线数据库，构建蛋白质相互作用网络，条件设定为：物种（homosapiens），最小相互作用分数（mediumconfidence，0.），去除游离的蛋白点。将获得的蛋白相互作用网络导入Cytoscape3.6.1软件使用NetworkAnalyer模块进行可视化处理分析。
2.7靶点功能富集
将2.4项筛选得到的交集靶点导入DAVID数据库，获得交集基因的功能以及在信号通路中的作用；通过输入名称列表并限定物种为“homosapiens”，设定阈值P0.05，进行GO生物学过程富集分析，选取前20个条目，将其结果利用GraphpadPrism绘制成柱状图；进行KEGG信号通路富集分析，使用R语言ggplot2数据库绘制气泡图，进行可视化。
2.8潜在有效成分-靶点分子对接验证
将含有靶点最多的活性成分通过PubChem下载其化学结构式，格式选择SDF，导入DiscoveryStudio4.0软件，再将2.6项所得与PD密切相关的靶点的晶体结构导入DiscoveryStudio4.0软件（IL-6，PDBID：1ALU；TP53，PDBID：3ZME；VEGFA，PDBID：4KZN；PTGS2，PDBID：5IKQ；TNF，PDBID：5MU8），采用CDOCKER模块进行对接，根据各晶体结构设定对接的活性坐标位置，其余均为默认值。
2.9大鼠原发性痛经模型建
立采用雌性SD小鼠，周龄5周，体质量~g。首先在正常的光照和适宜的温度环境中，用普通的固体饲料和自来水适应性喂养1周。随后将小鼠随机分为对照组，模型组，当归四逆汤低、中、高剂量组（1.5，3.0，6.0g·kg-1），布洛芬阳性对照组(20mg·kg-1)，每组10只。除对照组外，各组大鼠腹腔注射己烯雌酚注射液10d，每日1次，第1天和第10天0.8mg/只，第2～9天0.4mg/只；对照组注射等体积生理盐水。第4天起各给药组注射己烯雌酚后即灌胃相应治疗药物，对照组灌胃等体积生理盐水，每日1次。第10天末次给药1h后，对照组腹腔注射生理盐水0.2mL/只，其余各组大鼠腹腔注射宫缩素2U/只。麻醉处死小鼠，取血液进行下一步实验。
2.10指标检测与统计学方法
扭体反应次数：在大鼠给药前和第6天灌胃给药后2h记录其扭体反应的次数。在大鼠给药前和第6天给药后1h，腹腔注射0.6%醋酸（10mL·kg-1），记录所有大鼠在20min内发生扭体的次数。
子宫收缩抑制率和子宫指数：最后一次给药前，用戊巴比妥钠对大鼠进行麻醉，将其仰卧固定，于下腹部正中行5cm处切口，将子宫取出，在左侧子宫角选取3cm长的一段，将子宫角的阴道端与卵巢端分别缝在塑料“丫”型支架底的两端，在子宫两指点中固定一条棉线，自塑料管引出并连接至传感器，每组尾静脉注射0.U的缩宫素，5min后灌胃给予大鼠相应的药物，观察记录给药后1h大鼠子宫平滑肌的活动，随后称取并记录子宫的质量，计算子宫收缩抑制率及子宫指数。子宫收缩抑制率=（给予缩宫素后值－给予缩宫素前值）/给予缩宫素前值×%，子宫指数=子宫湿质量/体质量×%。
ELISA法检测大鼠子宫组织PTGS2和VEGFA水平及血清炎症因子（IL-6，IL-1，TNF-ɑ）表达：各组称重0.1g子宫组织，加入0.9mL生理盐水，组织匀浆器均匀混合，r·min-1离心10min，收集上清液；按试剂盒说明书进行操作，做出标准曲线，依次得出各组子宫组织中PTGS2和VEGFA的含量。按照实验分组收集各组细胞上清，r·min-1离心10min。按试剂盒说明书进行操作，做出标准曲线，依次得出各组血清炎症因子（IL-6，IL-1，TNF-ɑ）的含量。
本实验用SPSS26.0软件进行数据处理，计量资料用均值±标准差(`x±s)表示，组间比较采用t检验，P0.05为差异有统计学意义。
3结果3.1当归四逆汤中活性化合物的筛选
本实验通过TCMSP检索到当归四逆汤中的化合物，将条件设置为OB≥30%，DL≥0.18进行筛选，筛选出主要的活性化合物为个（已删除重复值），其中当归2个，桂枝7个，白芍13个，细辛8个，通草4个，甘草93个，大枣29个。
3.2当归四逆汤靶标蛋白与原发性痛经靶标蛋白交集分析
将上述个活性成分输入Drugbank中（剔除无靶点成分），进行活性靶标匹配，共得到当归四逆汤中潜在作用靶标个（已删除重复值）；通过GeneCards，OMIM和TTD数据库筛选到与原发性痛经相关靶点为个，两者之间交集见韦恩图，用交集得到的30个靶点反向筛选当归四逆汤的潜在活性成分，剔除不作用于这30个靶点的成分，得到作用于原发性痛经的相关活性成分个。当归四逆汤与原发性痛经共同靶点图见图1。
3.3中药-化合物-靶标-疾病网络的构建
将当归四逆汤治疗原发性痛经的靶点和对应的活性成分、药材构建中药-化合物-靶标-疾病网络，并将数据导入Cytoscape软件进行可视化。网络共有个节点（1种疾病、7味中药、个活性成分、30个潜在治疗靶点），每个化合物平均与3.8个靶点关联，每个靶点平均与4.34个化合物关联，因此当归四逆汤存在一个化合物作用于多个靶点，同时也存在不同化合物作用于一个靶点的现象，这正是中医药多成分、多靶点的重要证据。从化合物角度分析，有9个化合物作用靶点大于7，其中化合物MOL（槲皮素）、MOL（山柰酚）、MOL（7-甲氧基-2-甲基异黄酮）、MOL（葡糖苷）、MOL（3-hydroxy-4-O-methylglabridin）、MOL（1-甲氧基菜豆蛋白）、MOL（shinpterocarpin）、MOL065（medicarpin）和MOL（异鼠李素）分别能与22，13，8，7，7，7，7，7，7个靶点发生作用。从靶点角度进行分析，有10个靶点能8个和8个以上的化合物发生相互作用，其中PTGS2，ESR1，AR，PTGS1，ESR2，ADRB2，KDR，OPRM1，PGR，CHRM5分别能与，83，68，57，55，39，20，12，8，8个化合物发横相互作用。当归四逆汤“中药-化合物-靶标-通路-疾病”网络图见图2。
3.4当归四逆汤各药材交集化合物
当归四逆汤各药材重合韦恩图见图3。由中药-化合物-靶标-疾病网络，结合韦恩图可知，当归、桂枝、白芍、大枣共有MOL（β-谷甾醇）；桂枝、白芍、通草、甘草共有MOL（谷甾醇）；当归、大枣共有MOL（豆甾醇）；桂枝、白芍、大枣共有MOL（儿茶素）；白芍、细辛、甘草共有MOL（山柰酚）；白芍、甘草、大枣共有MOL（山柰酚）；甘草、大枣共有MOL（槲皮素）。
3.5蛋白相互作用网络
为了更直观地了解当归四逆汤原发性痛经的作用机制，将药物与疾病的交集靶点基因输入STRING数据库，将所得数据导入Cytoscape软件中制作蛋白相互作用网络。经软件分析得知，网络中共含有30个节点，条边，平均节点数13.3。Cytoscape软件对数据进行拓扑分析，发现VEGFA，IL6，PTGS2，TP53，TNF，EGFR，ESR1和IL1B这8个节点度值显著高于其他靶点，这些蛋白涉及炎症反应、细胞增生、细胞凋亡和雌激素受体等方面，提示上述靶点可能是当归四逆汤治疗原发性痛经的重要的靶点。蛋白相互作用网络见图4。
3.6功能富集分析
通过DAVID数据库进行对当归四逆汤和原发性痛经共同靶点进行GO功能富集分析，结果得到GO条目条（P0.05），其中生物过程条目（BP）条目为，细胞组成（CC）条目21个，分子功能（MF）条目25个，分别占88.47%，5.26%，6.27%，其中各组分排名前15的条目见图5。BP条目的前3条分别为regulationofcellproliferation（调节细胞增殖）、intracellularsignalingcascade（细胞内信号级联）、regulationofcelldeath（调节细胞死亡），提示当归四逆汤的靶点主要是与调节细胞增殖与死亡等密切相关。
通过KEGG富集筛选得到14条信号通路（P0.05），发现这些通路主要与癌症信号通路、细胞因子相互作用和炎症信号通路等有关，例如arachidonicacidmetabolism（花生四烯酸代谢）涉及IL6，TNF，CCL2，IL1B等基因，这提示当归四逆汤可能通过降低炎症反应起到治疗原发性痛经的作用，见图6。
3.7分子对接分析
通过PPI网络分析，发现VEGFA，IL6，PTGS2，TP53，TNF这5种蛋白与PD的发生具有密切的关系，通过中药-化合物-靶标-疾病网络，发现MOL（槲皮素）与22个潜在靶标相互作用，且与这个5个靶点都能发生相互作用，因此，本研究进一步利用计算模拟槲皮素与VEGFA，IL6，PTGS2，TP53，TNF结合。分子对接结果显示槲皮素均能与这5种靶点发生相互作用，见图7，如形成氢键、范德华力、Pi-Alkyl作用、Amide-PiStacked作用等，且与PTSG2的成键最为丰富。以上结果提示槲皮素可能是当归四逆汤的核心活性成分之一，其机制可通过与VEGFA，IL6，PTGS2，TP53，TNF这5个蛋白发生作用，达到治疗PD的作用。
3.8当归四逆汤可以降低原发性痛经模型引起的大鼠扭体次数和子宫指数的增高并升高子宫收缩抑制率
为了证明当归四逆汤对原发性痛经的作用，本研究分别检测大鼠扭体次数，子宫指数和子宫收缩抑制率，结果见表2。己烯雌酚处理明显增高了大鼠扭动次数和子宫指数，子宫收缩抑制率明显降低，而当归四逆汤以剂量依赖的方式降低了大鼠扭体次数和子宫指数，同时增高子宫收缩抑制率，其中以高剂量组效果最为明显，另一种阳性对照药布洛芬证明其作用。
3.9当归四逆汤抑制大鼠子宫组织中PTGS2和VEGFA的表达
为了证明当归四逆汤对原发性痛经引起的疼痛的影响，本研究分别检测了大鼠子宫中PTGS2和VEGFA的表达，结果见表3。与对照组相比，模型组大鼠子宫中PTGS2和VEGFA的表达均明显增高，而灌胃当归四逆汤低剂量组对PTGS2和VEGFA无明显抑制作用，其他给药组与模型组相比对PTGS2和VEGFA的表达具有明显的抑制作用，减轻了由痛经引起的疼痛，布洛芬证实了当归四逆汤的有益作用。
3.10当归四逆汤减轻由原发性痛经引起的炎症反应
为了研究当归四逆汤对原发性痛经引起的炎症反应的作用，本研究采用ELISA法检测大鼠血清中炎症因子IL-6，IL-1和TNF-ɑ的表达，结果见表4。与对照组相比，模型组炎症因子的表达明显上调；与模型组相比，除当归四逆汤低剂量组外，给药组炎症因子的表达均受到明显抑制，显示出明显的抗炎作用。
4讨论本研究利用网络药理学初步探讨了当归四逆汤治疗PD的作用机制，构建了“中药-活性成分-靶点-疾病”网络。当归四逆汤中活性成分或作用于多个靶点、通路，或多个成分作用于同一个靶点、通路，体现了当归四逆汤可通过多靶点、多途径发挥治疗PD的功效。
网络药理分析结果显示，槲皮素、山柰酚、7-甲氧基-2-甲基异黄酮、葡糖苷、3-hydroxy-4-O-methylglabridin、1-甲氧基菜豆蛋白、shinpterocarpin、medicarpin和异鼠李素等个成分为治疗PD的潜在活性成分。相关文献表明，槲皮素可以有效抑制环氧合酶2（COX2）促进子的转录活性，进而抑制花生四烯酸（AA）生成前列腺素类（PGs）等致炎症物质的产生，从而达到缓解PD疼痛的作用。山柰酚可以通过抑制炎症因子的表达，进而抑制环氧合酶和前列腺素E2的表达，达到减轻PD疼痛的作用。此外，异鼠李素已被证实可以通过不同靶标作用于细胞信号传导，减轻各种疾病中的炎症反应，例如异鼠李素可以降低糖尿病大鼠TNF-α的表达，故推测其可能通过减少炎症因子异常分泌起到治疗PD的疗效。
KEGG通路分析结果显示，癌症途径、细胞因子与细胞因子受体的相互作用、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路和花生四烯酸代谢等信号通路具有显著性差异，其中MAPK信号通路和花生四烯酸信号通路与PD的发生密切相关。MAPK信号通路是生物体内重要的信号转导系统之一，参与介导细胞生长、发育、分裂、分化等多种生理病理过程，与炎症、肿瘤等多种疾病的发生密切相关。研究报道，MAP激酶可以调节多种炎症细胞因子的表达，可上调细胞外信号相关激酶（ERK），c-JunN端激酶（JNK/SAPK）和p38MAPK激酶，导致炎性细胞因子产生，进而导致PD的发生。AA经脂加氧酶作用生成白三烯，白三烯为炎症介质，可活化白细胞使白细胞趋化、聚集、粘附于血管内皮细胞，增加血管通透性。已有研究报道，白三烯可以合成前列腺素导致平滑肌收缩，导致PD的产生；此外，白三烯增加血管通透性可导致疼痛的产生，而PD患者的子宫平滑肌中存在高水平的白三烯，因此，白三烯的水平与PD密切相关。
PPI蛋白相互作用网络显示，VEGFA，IL6，PTGS2，TP53，TNF，EGFR，ESR1和IL1B这8个节点度值显著高于其他靶点，其中靶点蛋白PTGS2和ESR1在分析结果中排名靠前，且与化学成分密切，起着至关重要的作用。靶点蛋白ESR1编码一种雌激素受体，该雌激素受体与雌激素结合，激活血清肥大细胞，释放致痛物质，导致原发性痛经的发生。当归四逆汤中的活性成分与体内的雌激素竞争相应受体，产生类雌激素作用，但不会增加PCF-2α的合成，从而减少子宫的异常收缩，缓解因子宫收缩或者血供不足引起的原发性痛经疼痛。
PTGS2是前列腺素类生物合成途径中的双重环氧合酶和过氧化物酶，在炎症反应中起特殊作用。子宫内膜PG升高可导致原发性痛经。原因是PG可引起子宫平滑肌痉挛性收缩，导致子宫缺血缺氧，使酸性代谢物积聚在肌层引起痛经。此外，PG还可以增加子宫平滑肌周围神经对疼痛敏感，进而引起痛经。分子对接结果显示槲皮素能与PTGS2的ARG，TYR，TYR，MET，SER形成氢键，PHE，VAL形成范德华力，LEU，VAL，ALA形成疏水结合Pi-Alkyl作用，GLY形成Amide-PiStacked作用。提示四逆汤通过其活性成分与关键蛋白发生相互作用而达到治疗痛经目的。
此外，本研究进行了体内原发性痛经的造模，模型明显的表现出大鼠扭体次数和子宫指数升高以及子宫收缩抑制率降低，还伴有子宫组织中指标PTGS2和VEGFA的表达增加，同时引发炎症反应。实验结果显示，当归四逆汤以剂量依赖的方式降低大鼠扭体次数和子宫指数并增高子宫收缩抑制率，同时我们发现当归四逆汤的中高剂量组可以显著抑制子宫组织中PTGS2和VEGFA和血清中炎症因子（IL-6，IL-1，TNF-ɑ）的表达，以上现象均表明当归四逆汤可以缓解由原发性痛经引起的疼痛和炎症反应。
本研究以经典名方当归四逆汤的活性成分为研究对象，应用网络药理学和分子对接的方法，通过建立一条涵盖“中药-活性化合物-通路-疾病”的中药复方网络，分析其治疗PD的可能作用靶标和途径；结果揭示了当过四逆汤可以通过多成分、多靶点、多途径、多通路治疗PD，为后续深入研究当归四逆汤治疗PD的作用机制奠定了基础。
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