干货福利我国病毒性疫苗技术与行业发展回
新中国成立前，我国仅有牛痘、霍乱疫苗等少数预防烈性传染病的疫苗可以使用。建国70年来，国家大力推动的计划免疫，特别是改革开放后疫苗行业市场机制的引入与深化，促进了我国生产的疫苗品种迅速增加，疫苗产业进入高速发展期，至年我国疫苗产能已达到全球第一。多种烈性传染病得到根除或有效控制，我国疫苗事业取得了世界瞩目的巨大成就。
文末有福利，记得读完喔！1我国病毒性疫苗行业的发展历史我国第一个从事疫苗研究与生产的专业机构是成立于年的中央防疫处(北京生物制品研究所前身)，在战时极端困难条件下生产出世界首支斑疹伤寒疫苗，以及之后中国自产的狂犬病疫苗、白喉疫苗、牛痘疫苗。新中国成立后卫生部先后在北京、上海、武汉、成都、长春、兰州成立6个生物制品研究所。在昆明建立了一个主要研究脊髓灰质炎疫苗和恒河猴实验动物的中国医学科学院医学生物学研究所，年该所成功研发全球创新的一类新药Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗(SabinIPV)，打破了市场的垄断。
改革开放以后，一大批优秀民营企业如华兰生物、智飞生物、科兴生物和国际疫苗巨头企业如葛兰素史克、赛诺菲、辉瑞和默沙东相继进入我国疫苗市场。在日益成熟的市场竞争机制下，我国疫苗产业向着标准化、制度化、法制化迈进。年重症急性呼吸综合征(SARS)的爆发，H1N1流感的爆发和年国家扩大免疫规划等因素叠加，国内疫苗市场也从年不足30亿元迅速增加到年亿元，年达到亿元，复合增速接近13%，远高于全球市场平均水平。目前，我国疫苗产业产能已达到全球第一，且仍处于高速发展期，预计到年我国疫苗市场规模将达到亿元。
目前中国疫苗市场总共有10家国企、23家民企和6家外资企业，其中本土企业可以生产疫苗43种,外资企业在中国销售疫苗14种。
截至年12月31日，我国上市的病毒类疾病预防性疫苗约23种，可预防32种感染性疾病，主要有：麻疹、腮腺炎、风疹、水痘、甲型肝炎、乙型肝炎、戊型肝炎、脊髓灰质炎、狂犬、季节性流感、轮状病毒感染、乙型脑炎、森林脑炎、黄热病、流行性出血热、人手足口、天花、甲流H1N1、禽流感H5N1。
2疫苗行业发展的机遇和挑战改革开放以后，通过计划疫苗项目、“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治”“重大新药创制”国家科技重大专项以及“十三五”国家重点研发计划“生物安全关键技术研发”等重点专项的组织实施，我国病毒类疫苗研发取得了显著成绩，已经建立比较完善的病毒类疫苗技术研发体系。我国在国际上率先研制成功了重组戊型肝炎疫苗、手足口病(EV71型)疫苗和埃博拉疫苗等创新产品。我国已申请临床或在临床阶段的病毒类疫苗有多种。“十二五”时期，我国疫苗监管体系通过了WHO评估，标志着我国疫苗监管体系走在了世界前列。
此前，国内疫苗市场波澜不惊，主要的原因是多个重磅品种未登陆国内市场，供给端的限制造成了疫苗市场整体停滞不前。国际上重磅疫苗大多为年前获批上市，国内外上市产品存在较大的代际差异。然而年EV71疫苗与二价HPV疫苗，年四价HPV疫苗，年九价HPV疫苗、五价口服轮状病毒疫苗与四价流感，年GSK的重组带状疱疹病毒疫苗等重磅疫苗相继获批上市后，叠加未来几年内其他国产重磅疫苗的陆续上市，我国病毒类疫苗市场的产品结构将得到大幅优化。
病毒类疫苗商业化价值不弱于创新药，且与创新药相比，疫苗更具爆发性强、生命周期长、产品迭代慢的属性。一方面疫苗是预防属性，每年面临着国内万左右的新生儿数量，接种人群基数较大。与此同时，疫苗从获批到上市的环节相对较少，获批后就可以在各省公共资源管理平台动态挂网，能够较快的覆盖到终端，一般四五年时间就能达到销售峰值。另一方面，疫苗相对而言技术迭代较慢，全球销售额前十的病毒类疫苗基本上都是年前上市的，目前这些疫苗仍然保持较高的销售额且维持良好的竞争格局，因此病毒类疫苗产品的生命周期比较长。从国外疫苗企业或者项目的并购案例可以看出，疫苗产业往往有较高的估值。
疫苗行业监管趋严，业内重组整合是趋势。年7月长生生物事件既暴露出国内疫苗监管不到位等诸多漏洞，也反映出疫苗生产流通使用等方面存在的制度缺陷，未来国内药品的监管势必将会强化。从年第四季度及年以来多个疫苗批签发量均呈现同比下滑现象可以看出，中检院的批签发制度执行已经开始趋严。疫苗行业重组整合工作的主要措施包括：提高市场准入标准，严格控制新开办疫苗企业；加强疫苗质量监管，逐步引导落后产品退出；支持协会制定发布行业发展指南，引导产业有序发展；鼓励大型企业疫苗中标配送，推动优势企业加快发展等，叠加疫苗管理法有望年内颁布落地，将会加快推动疫苗行业重组整合。
3病毒类疫苗生产技术特点及不足目前法定一类二类病毒类人用疫苗的生产工艺过程中,有两种重组乙型肝炎疫苗是使用重组CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)和重组酵母菌生产乙型肝炎表面抗原蛋白质作为疫苗抗原,其他病毒类疫苗生产中病毒的培养方式全是在动物细胞中,包括,通过原代细胞培养方式、通过人二倍体细胞或Vero细胞培养方式、在鸡胚中培养方式。
细胞培养作为多数疫苗生产的主要方式，使得大规模细胞培养成为一种发展趋势，而反应器悬浮培养动物细胞技术、无血清培养技术就成为当前各大生物公司产业化生产病毒类疫苗的首要选择和发展方向。在大规模疫苗生产中实现细胞高密度培养、提高单位制品的表达产量、简化生产工艺、降低生产成本、保证大规模生产疫苗质量都有着极为重要的作用。
传统贴壁细胞为基质的病毒性疫苗生产，细胞培养工艺目前主要分为两类：一类为传统的贴壁培养模式，包括转瓶和细胞工厂。贴壁生产工艺生产效率低，独立的培养容器（转瓶或细胞工厂）导致批间差异大，难以达到不同培养容器间病毒收获液质量的一致性。另外，大量转瓶和细胞工厂的操作，给无菌的控制带来很大的难度。不同操作人员的技术水平也会影响病毒扩增和收获的结果。下表为传统生产工艺与反应器的对比。
第二类为低密度微载体生物反应器培养模式。这类培养工艺，是将不能悬浮培养的基质细胞，贴附在例如Cytodex1这样的微载体上，再通过微载体在生物反应器内悬浮进行培养。相对于传统的转瓶和细胞工厂，生物反应器可以将细胞的生长和维持环境保持在稳定、可控的状态。对于严格的药品生产来说，生物反应器可以保证每批次生产工艺的稳定性，同时做到生产的数据化管理。
但是，受限于微载体和贴壁细胞的特性，常规的搅拌式生物反应器进行罐转罐的放大培养工艺难度较大，同时常规的PB（斜叶桨）搅拌桨也不能满足高细胞密度对营养物质和氧的需求。常规的反应器微载体投放量仅能达3-5g/L，细胞密度3.0-4.0x个/ml。随着细胞密度的增加，营养消化会加快，细胞代谢副产物也会累积，最终导致细胞难以维持良好的状态。
4解决方案在我国，动物细胞生产病毒类疫苗生产工艺中，仍然有相当多的企业采用转瓶或细胞工厂来培养动物细胞，而如何将细胞反应器悬浮培养和微载体培养技术应用到研发和生产中正在成为我国病毒类疫苗生产企业技术革新和和产业升级的重要内容。我国应该在此领域加大投入，集中国内优势企业的力量协同攻关，并与国外先进产品企业加大合作，充分利用生物反应器高密度培养细胞、大幅提高单位抗原产量和疫苗产品质量的优势，建立符合GMP标准的疫苗生产平台。
以贴壁细胞为基质的病毒性疫苗大规模生产，其中最重要的关键环节之一在于提高细胞密度和维持细胞状态。通过多年的技术累积，目前eppendorf公司为我们提供两种解决方案：
一、高密度微载体细胞培养。利用提升式搅拌桨（Cell-lift），可将Cytodex1的投放量提高至最高25g/L，细胞密度可达1.2-1.5x个/ml。如下图。再通过配备的灌流沉降系统，可以进行最高2个工作体积/天的连续灌流培养。为高密度的细胞生长和维持提供营养保证。无泡式通气系统，使培养过程不再需要考虑消泡控制。但微载体培养工艺对细胞的状态要求极高。细胞感染病毒后，病变快的细胞会在早期就因为状态差而脱落，而病变慢的细胞也会在后期脱落，在微载体上尤为明显。细胞脱落后因为搅拌因素形成碎片，细胞内的DNA也会被释放到病毒收获液中，为后期的纯化带来巨大的压力。
不同培养方式对狂犬病毒滴度的影响（来源GE《微载体培养手册》）
二、片状载体篮式反应器（型号为BioFlo）应用于细胞培养。该反应器能兼容可高温灭菌玻璃罐体和一次性使用罐体，配置智能传感器，可通过IP网络连接多台罐体串联控制，可适用各种微生物和细胞培养模式，如规模放大/缩小、批次、流加和连续培养模式，能满足生物技术和制药行业各个领域不断变化的需求。除了标准的搅拌桨，Eppendorf还提供特殊的搅拌桨来支持连续及灌流培养过程：旋转过滤器、细胞提升式搅拌桨和填充床式搅拌桨。
片状载体（Fibra-Celdisk）是成三维结构的聚酯纤维，拥有很高的强度，在罐内可以进行叠加、压缩。如下图。片状载体装载在固定的罐内篮中，细胞接种后，通过快速的穿梭载体，被截留在载体内部，贴壁并生长，一般接种后到液体澄清仅需要30分钟。由于细胞和载体都在篮中，不和搅拌桨接触，通气系统也不经过篮内，因此培养过程中，搅拌的剪切力对细胞伤害微乎其微，而气泡也不会对细胞造成任何影响。细胞在篮式反应器内细胞密度最高可达4.5x个/ml。病毒接种后，如果需要更换培养基，可以进行快速的完全换液，将培养基更换成无血清或指定维持培养基。尽管片状载体是累积在固定篮内，但细胞生长增殖是均匀的，不同部位的细胞数量基本一致。片状载体的截留功能，让细胞在感染病毒后状态极差的情况下，也不易从固定篮的载体内脱落而释放到上清中，减少了细胞碎片的产生和宿主细胞DNA的累积。
篮式生物反应器结构示意图
下表为3种常见反应器在病毒性疫苗生产工艺中的对比，下列3类反应器eppendorf生物工艺产品部门均可为客户提供相应解决方案：
国内已有多家疫苗生产厂家使用生物反应器，生产工艺来生产疫苗。例如辽宁成大使用微载体或片状载体在生物反应器中进行细胞培养生产狂犬疫苗，该疫苗具有效价高、杂质少、稳定性好的特点。在上市以来打破了国外企业在此疫苗中的垄断，目前已成为全球生产量最高、使用范围最广泛、市场占有率最高的人用狂犬疫苗产品。已经出口到30多个国家和地区，累计使用量达到2亿多人份，品质得到了国际认可。长春卓谊生物股份有限公司、广州诺诚生物制品股份有限公司的狂犬疫苗产品都已使用反应器进行细胞培养。
图片来自：成大生物
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